The Difference in Chemokine Expression in Airway Epithelial Cells According to the Virulence of Tubercle Bacilli

결핵균 독성 여부에 따른 기도 상피세포의 Chemokine 발현에 관한 연구

Background : We have recently reported that airway epithelial cells can produce RANTES and IL-8 in response to the stimulation of tubercle bacilli suggesting a certain role of airway epithelial cells in the pathogenesis of pulmonary tuberculosis. The pathogenesis of tuberculosis is determined by several factors including phagocytosis, immunological response of host, and virulence of tubercle bacilli. Interestingly, there have been reports suggesting that difference in immunological response of host according to the virulence of tubercle bacilli may be related with the pathogenesis of tuberculosis. We, therefore, studied the expressions and productions of RANTES and IL-8 in airway epithelial cells in response to tubercle bacilli(H37Rv, virulent strain and H37Ra, avirulent strain), in order to elucidate the possible pathophysiology of pulmonary tuberculosis. Methods : Peripheral blood monocytes were isolated from normal volunteers. Peripheral blood monocytes (PBM) were stimulated with LPS($10{\mu}g/ml$), H37Rv, or H37Ra($5{\times}10^5$ bacilli/well) along with normal control for 24 hours. A549 cells were stimulated with supernatants of cultured PBM for 24 hours. ELISA kit was used for the measurement of $TNF{\alpha}$ and IL-$1{\beta}$ production in supernatants of cultured PBM and for the measurement of RANTES and IL-8 in supernatants of cultured A549 cells. Northern blot analysis was used for the measurement of RANTES and IL-8 mRNA expression in cultured A549 cells. Results : $TNF{\alpha}$ and IL-$1{\beta}$ productions were increased in cultured PBM stimulated with LPS or tubercle bacilli(H37Rv or H37Ra) compared with the control. There was, however, no difference in $TNF{\alpha}$ and IL-$1{\beta}$ production between cultured PBM stimulated with H37Rv and H37Ra. RANTES and IL-8 expressions and productions were also increased in cultured A549 cells stimulated with LPS or tubercle bacilli compared with the control. RANTES and IL-8 mRNA expressions were significantly increased in cultured A549 cells stimulated with H37Ra-conditioned media(CM) compared with A549 cells stimulated with H37Rv-CM (p<0.05). However, there was no difference in RANTES and IL-8 productions between A549 cells stimulated with H37Rv-CM and H37Ra-CM. Conclusion : Airway epithelial cells can produce the potent chemokines such as RANTES and IL-8, in response to the stimulation of tubercle bacilli. These results suggest that airway epithelial cells may play a certain role in the pathogenesis of pulmonary tuberculosis. However, the role of airway epithelial cells in the pathogenesis of tuberculosis according to the virulence of tubercle bacilli was not clear in this study.

연구배경 : 저자들은 최근 결핵균의 자극에 의해 peripheral blood monocytes (PBM)에서 IL-$1{\beta}$와 $TNF{\alpha}$가 생성되고, 기도상피세포에서는 IL-8과 RANTES와 같은 chemokine이 생성된다는 사실을 밝힌 바 있다. 이와같은 사실은 기도상피세포가 IL-8과 RANTES와 같은 chemokine을 분비함으로써 결핵의 병인에 능동적으로 참여함을 시사한다고 하겠다. 기도상피세포에서 발현하는 chemokine들이 결핵의 병태생리에 관여한다면, 폐결핵을 일으키는 가진 균주인 H37Rv와 폐결핵을 일으키지 않는 균주인 H37Ra로 자극하였을때 기도상피세포에서 분비되는 chemokine의 성상이 다를 것이라는 가정이 가능하다. 실제로 독성을 가지고 있는 Erdman 균주와 독성을 가지고 있지 않는 H37Ra의 lipoarabinomannan(LAM) 의 구조가 다르고, 이 LAM으로 대식세포를 자극하였을때 H37Ra LAM은 대식세포에서 $TNF{\alpha}$를 생성시키지만 H37Rv LAM은 $TNF{\alpha}$를 생성시키지 못하고 이와같은 차이가 결핵균에 대한 생체의 방어기전을 설명한다는 보고가 있다. 본 연구는 폐결핵의 병태생리에서 기도상피세포의 역할을 규명하고자, 독성이 있는 균주인 H37Rv와 독성이 없는 균주인 H37Ra를 사용하여 결핵균의 독성여부에 따른 기도상피세포에서 분비되는 chemokine의 차이를 연구하고자 하였다. 방 법 : 정상인에서 채취한 말초혈액에서 말초혈액 단핵세포(PBM)를 분리하여, sonicated H37Rv, H37Ra($5{\times}10^5$ bacilli, A TCC) 또는 LPS($10{\mu}l/ml$)로 자극하면서 24시간 동안 배양하였다. 또한 PBM에 대한 interferon gamma($IFN{\gamma}$)의 영향을 평가하고자 PBM를 결핵균으로 자극하기 한 시간전에 $IFN{\gamma}$(10ng/ml, R & D) 로 전처치한 군과 $IFN{\gamma}$ 전처치 없이 자극한 군을 두었다. 24시간후 상층액을 채취하여 상층액의 일부는 $-70^{\circ}C$에서 보관하였고 이후 ELISA kit(R & D)를 이용하여 $TNF{\alpha}$와 $IL-1{\beta}$의 농도를 측정하였다. 배양된 PBM의 상충액(1 : 2 희석액 )으로 배양된 A549 세포를 다시 자극하면서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양후, 상층액은 IL-8, RANTES의 측정을 위하여 $-70^{\circ}C$에서 보관하고, 남아있는 A549 세포에서 tRNA를 추출하였다. 배양 상층액에서는 ELISA kit(R & D)를 이용하여 IL-8, RANTES의 농도를 측정하였고, 추출한 tRNA는 Northern blot analysis를 이용하여 IL-8, RANTES의 mRNA의 양을 측정 정량하였다. 결 과 : 말초혈액 단핵세포를 LPS, H37Rv, 또는 H37Ra로 자극하였을 때 대조군에 바하여 $TNF{\alpha}$와 IL-$1{\beta}$의 생성이 읖미 있게 증가하였다. 독성이 없는 H37Ra로 자극하였을 때가 독성이 있는 H37Rv로 자극하였을 때보다 $TNF{\alpha}$와 IL-$1{\beta}$의 생성이 많았으나 통계적인 유의성은 없었다. $IFN{\gamma}$로 전처치하였을 때 $TNF{\alpha}$와 IL-$1{\beta}$의 생성이 전처치하지 않은 군에 비해 증가하였으나 H37Rv군과 H37Ra군 사이에 통계적으로 유의한 차이는 없었다. A549 세포를 결핵균이나 LPS로 자극한 말초혈액 단핵세포 배양액으로 자극하였을 때, RANTES와 IL-8 의 유전자 발현이 대조군에 비하여 의미있게 증가하였다(p<0.001). 또한 H37Ra 배양액으로 자극한 군에서 H37Rv 배양액으로 자극한 군에 비하여 RANTES와 IL-8의 유전자 발현이 의미있게 증가하였다 (p<0.05). A549 세포를 결핵균이나 LPS로 자극한 말초혈액 단핵세포 배양액으로 자극하였을 때 RANTES와 IL-8의 생성이 대조군에 비하여 의미있게 증가하였다. 그러나 유전자 발현과는 달리, H37Ra 배양액으로 자극한 군에서 H37Rv 배양액으로 자극한 군에 비하여 RANTES와 IL-8의 생성이 증가하였지만 통계적인 유의성은 없었다. 결 론 : 기도상피세포는 폐결핵에서 RANTES와 IL-8과 같은 강력한 chemokine을 분비하여 염증반응을 증폭시킴으로써 폐결핵의 병인에 능동적으로 참여함을 추정할 수 있었다. 그러나 말초혈액 단핵세포에서의 $TNF{\alpha}$와 IL-$1{\beta}$의 생성은 결핵균주의 독성여부에 따라 차이가 없었고, A549 세포에서도 RANTES와 IL-8의 유전자 발현은 H37Ra 에서 유의하게 증가하였으나 RANTES와 IL-8의 생성은 유의한 차이가 없어 결핵균의 독성 여부가 균주에 따른 생체의 면역반응즉 chemokine 생성의 차이 때문이라는 본 연구의 가설을 증명할 수는 없었다.