Abstract
Bacillus licheniformis 9945a releases a natural ${\gamma}-poly(glutamic\;acid)({\gamma}-PGA)$ into fermentation broth and shows a mucoid phenotype on the solid agar medium. Transformation of mucoid cells of Bacillus species has not been simple and straightforward. The transpositional activity of Tn10 in B. licheniformis also has not been own either. Thus, a spontaneous non-mucoid derivative of the B. licheniformis was obtained first. Shuttle vector pHV1248 containing mini-Tn10 was introduced into the non-mucoid derivative by the method of protoplast transformation. The resulting transformant was reverted to the wild mucoid phenotype, and then mutated randomly with the mini-transposon by heat induction. Auxotrophs requiring arginine, lysine, or tryptophan were isolated by replica plating method. Southern blotting and DNA-DNA hybridzation analysis showed that these auxotrophs were generated by mini-Tn10 insertion into the chromosomal DNA. This method of transformation and mutation using pHV1248 would be useful for the generation of diverse mutants of B. licheniformis 9945a.(Received January 24,1997; accepted March 10, 1997)
Bacillus licheniformis 9945a는 액체배양시 ${\gamma}-poly(glutamic\;acid)$를 균체외로 분비하며, 한천배지에 고체 배양시는 점액질의 군락을 나타낸다. 점액질의 Bacillus속 세균의 형질전환은 그리 순하지 않은 것으로 알려져 있으며, B. licheniformis에서의 trasposon Tn10의 활성여부도 알려져 있지 않다. 그래서 점액질을 분비하지 않는, B. licheniformis의 자연발생적 변이주를 우선 분리하였다. Mini-Tn10을 함유한 plasmid pHV1248을 protoplast transformation법에 준해서 이 변이주에 도입하여 형질전환체를 분리하였다. pHV1248을 함유한 형질전환체를 점액성의 야생형질로 복귀시킨 후에, 가열처리함으로써 무작위 돌연변이를 유도하였다. Arginine, lysine 또는 tryptohan을 생육인자로 요구하는 돌연변이주들이 replica plating method에 의해서 분리되었고, 이 들 영양요구성 변이주는 mini-Tn10이 염색체 DNA상에 삽입됨으로써 생겨났음이 Southern blotting과 DNA-DNA 혼성화 실험으로 증명되었다. 이러한 pHV1248을 이용한 형질전환 및 돌연변이 유도방법은 Bacillus licheniformis 9945a의 다양한 변이체를 얻는데 유용할 것이다.