Purification of Biosynthesized Hyaluronic Acid for Its Medical Application

생합성 히아루론산의 의료용을 위한 정제

Purification of hyaluronic acid produced by Streptococcus equi was carried out to obtain clinical grade hyaluronic acid. The removal method of the bacteria was selected as filtration because filtration was the most effective method in removing impurities such as protein and nucleic acid of the fermentation broth. The removal efficiencies of protein and nucleic acid of hyaluronic acid solution were increased to 75% and 67%, respectively, by filtration with adding 0.6% of activatied carbon and 1.0% colite. Hyaluronic acid solution was precipitated by mixing with 2 volumes of ethanol. Effects of pH and conductivity on ethanol preciptation of hyaluronic acid were investigated. Protein and nucleic acid of hyaluronic acid were remained almost constant regardless of pH and conductivity, and the recovery of hyaluronic acid was optimum as about 85% at pH 7 and l00mS of conductivity Protein of hyaluronic acid was completly removed by three serial filtration and ethanol precipitation, however, nucleic acid was not removed. Hyaluronic acid solution was passed through a column of Duolite A7 to remove its nucleic acid, where 65% of nucleic acid was removed at pH 7 and 40mS of conductivity. The residual nucleic acid of hyaluronic acid solution was completly removed by treatment of 0.2% hydroxyapatite and the clinical grade hylauronic acid could be obtained.

히아루론산 정제과정 중 불순물인 핵산과 단백질 을 제거하기 위하여 여러 가지 균체제거 실험을 수 행한 결과 여과에 의한 방법이 히아루론산 용액 중 의 단백질과 핵산이 가장 잘 제거되었다. 보다 효과 적요로 핵산과 단백질을 제거하기 위하여 활성탄과 규조토를 첨가하여 여과하였다. 여과시 히아루론산 의 회수율과 핵산 및 단백질 제거율을 살펴 본 결과 활성탄 농도 0.6%와 규조토 농도 1.0% 첨가하는 경우를 최적 여과조건으로 선정하였다. 에탄올 첨가 는 에단융과 히아루론산 용액을 동시에 첨가하는 경우에 히아루론산의 회수율과 핵산 및 단백질 제거율 이 가장 좋았다. 에탄올에 의한 히아루론산의 침전 시 최적조건을 찾기 위해 pH와 전도도를 변화 시키 는 실험을 수행하였다. pH와 전도도에 따른 핵산과 단백질의 제거 정도는 큰 차이를 보이지 않았고 에 탄올에 의한 히아루론산의 침전은 pH 7. 전도도 100mS(l.OM NaCI 정도에 해당)에서 최적이었으며, 이때 히아루론산의 회수율은 약 85% 정도이였 다. 에탄올 침전과 여과 과정에서 히아루론산 용액 중의 단백질은 거의 제거되었으나, 핵산은 완전히 제거되지 않았다. 핵산을 완전히 제거하기 위하여 Duolite A 7 수지를 통과시킨 결과 pH 7, 전도도 4 40mS 부근에서 핵산제거율이 65%로 가장 좋았다. 히아루론산 용액 내의 잔존 핵산은 hydroxy-apatite 0.2%를 처리하여 거의 제거 할수 있어 그 결과 불 순물인 핵산과 단백질이 각각 0.02%. 0.01 % 이하 인 의료용 히아루론산을 만들 수 있었다.