AprE Promoter전이상태 조절인자 변이주를 이용한 공업적 효소의 과발현과 고초균 숙주계의 개발

The Overexpression of Subtilisin Enzyme Using Mutations on Transition State Regulatory Proteins of AprE Promoter and Development of Bacillus subtilis Host System

Bacillus subtilis를 재조합이종 단백질 생산에 응 용하고 그 발현효율의 향상을 위하여, aprE 프로모 터를 모델계로서 이에 작용하는 전이상태 조절유전 자 변이와 포자형성변이의 영향을 살펴보았다. 사용 된 균주는 두 개의 프로테아제가 제거된 DB104이며, 조절인자 변이주는 $degU^h$와 hpr을 각각 활성인자와 억제인자로 선택하였고, 이중변이주는 DB104 ($\DeltaspoIIG(Pm) degU^h his^+$) 및 DB104($\DeltaspoIIG(Pm) \Deltahpr(Em)$) 를 제조하였다. 이에 목적유전 자연 aprE유전자를 재조합하여 변이에 의한 과발현 양상을 확인하였다. degUh 및 hpr 조절변이주는 야 생주와 비교하여 각각 약 7배 빛 약 2배의 발현효율 향상을 보여주었다. 이들 전이상태 조절유전자 변이 는 모두 목적유전자 복제 수의 증가에 따라 발현효 율의 감소를 나타내어 증폭된 목적유전자에 대한 조 절유전자의 희석효과(gene dosage effect)를 확인할 수 있었다. 이중변이주 DB104($\DeltaspoIIG(Pm) degU^h his^+$)::pMK101 및 DB104($\DeltaspoIIG(Pm) \Deltahpr(Em)$)::pMK101에서의 aprE 발현은 각각 약 10배 빛 3배의 발현증가를 가져와 aprE 발현에 대한 포자변이주 및 전이상태 조절유전자의 독립적인 부가효과를 확인하였다.

Bacillus subtillis strains with transition state regulator mutations and a spore mutation were developed for the overexpression of apsE and for the enhancement of expression level. Among the many regulator genes, degU and hpr were chosen as a representative positive and negative regulator for the aprE, respectively. Spo II G was used for the construction of asporogeneous strains. All the mutants were constructed from two protease-deleted strain DB104 and the apsE gene was transformed with an integration vector pMK101. DB104(deg$U^h$(32) $his^+$)::pMK101(Cm) and DB104($\Delta$her(Em))::pMKl01(Cm) show 7-fold and about 2-fold increase in aprE expression level, respectively. But the effect of transition state regulator mutation on the aprE expression was diminished when the integrated aprE gene was amplified by the high concentration of chloramphenicol, i. e. 30 $\mu\textrm{g}$/ml. DB104($\Delta$spoIIG(Pm) degUh(32) his+)::pMK101(Cm) and DB104($\Delta$spoIIG(Pm) $\Delta$hpr(Em))::pMK101 double mutant show 10-fold and 3-fold increase in aprE expression level, respectively. The results suggest that sporulation mutation and transition state regulator mutation have independent and additive effect on the aprE expression, and the same gene dosage effect on the transition state regulator mutation was also identified.