Thermoanaerobacter ethanolicus Amylopullulanase Thermophilicity와 Thermostability의 Molecular Analysis

Thermoanaerobacter ethanolicus유래 thermophilic amylopullulanase의 thermophilicity와 thermostability의 기작을 규명하기 위하여 N-말단과 C-말단으로부터 nested deletion mutatnt와 sitedirected mutagenesis등에 의한 변이효소를 제조, 분석하였다. 이러한 까다로운 변이효소를 제조하여 amylopullulanase의 특정부위가 효소의 thermophilicity와 thermostability에 관여하고 있는 것을 확인했다. N-말단의 start amino acid에서 194와 324 아미노산잔기에 이르는 부위 (TPR)가 이 효소의 높은 최적반응온도의 유지에 관련되어 있고 1102와 1224잔기에 이르는 부위 (TSR)는 thermodenaturation이 잘 일어나지 않도록 하고 있었다. 야생형 amylopullulanase (Apu), 변이효소중 ApuN342와 ApuN106/C379는 비슷한 효소비활성과 Km값을 가지고 있었다. TPR부위의 site-directed mutagenesis에 의한 변이효소중 P240A (proline$\rightarrow$alanine), P244A, P240A-P244A는 야생형의 최적반응온도 $80^{\circ}C$와 똑같았지만 효소의 열안전성(반감기)는 $85^{\circ}C$에서 21, 105, 128분을 보여 주었다. TSR에서의 변이효소중 P1159A, P1202A는 열안전성은 비슷하였지만 반응최적온도는 $85^{\circ}C$와 $90^{\circ}C$로 야생형 Apu보다 오히려 높아졌다. 따라서 proline은 분자내에서 thermophilicity와 thermostability를 항상 증가시키는 쪽으로 영향을 주지 않는 것으로 보인다. Proline은 그 위치와 주위의 다른 아미노산잔기와 같이 종합적으로 분자의 구조에 영향을 미치고 있는 것으로 판단된다.