Clonig of CM-cellulase Gene of Rhizobium meliloti TAL1372 in Escherichia coli

Rhizobium meliloti TAL1372에서 섬유소분해효소 유전자 클로닝

The involvement of the cell-wall degrading enzymes in Rhizobium has long been an unsolved question about the infection process in the formation of root nodule. To assess the contribution of the cellulase to the nodulation of rhzobia, here we report the production of cellulase from R. meliloti TAL1372 which degrade carboxymethylcellulose (CMC) model substrate with CMC-plate method. We constructed a genomic library by cloning Sau3A-digested genomic DNA from R. meliloti TAL1372 into the BamHI site of the cosmid vector pLAFR3. Out of more than one thousand transductants of E. coli, one clone (pRC8-71) had CM-cellulase activity and contained pLAFR3 cosmid with 30 kb insert of R. meliloti DNA The product of CM-cellulase gene was analyzed by native PAGE. About 45 kD protein was considered to be a product of the gene. Tn5 mutagenesis reveals that the structural gene located in a ca. 3 kb KpnI fragment. The cellulase-minus mutants of R. meliloti TAL1372 were obtained by Tn5 mutagenesis of pRC8-71 and marker exchange techniques. Analyses of the nodulation ability of these Tn5 mutants showed that the CM-cellulase gene of R. meliloti TAL1372 may be involved in early nodulation development on alfalfa (Medicago satiua).

본 실험은 알팔파(Medicago sativa) 근류균인 Rhizobium meliloti TAL1372 균주에서 섬유소분해효소의 활성을 확인하고 이 유전자를 크로닝하기 위해 코스미드 벡타인 pLAFR3를 사용하여 유전자 은행을 만들었다. 이 유전자 은행으로 부터 분리한 1,000개의 형질 도입체에서 CM-cellulase(carboxymethylcellulase) 활성이 있는 클론(pRC8-71) 하나를 분리하였으며 30kb 크기의 R. meliloti DNA 단편을 함유하고 있는 것을 확인하였다. 이 CM-cellulase 유전자의 발현 산물을 native PAGE 법에 의하여 분자량을 측정한 결과 약 45kD 정도의 크기로 추정되었으며 pRC8-71로 부터 Tn5 변이법에 의해 조사한 결과 30kb 단편 내에서 CM-cellulase 유전자의 위치는 제한효소 KpnI에 의해 절단되는 약 3kb 단편에 존재하였다. 표시교환 변이법에 의해 야생균주 R. meliloti TAL1372로부터 cellulase 무생산 변이체를 얻어 근류형성 정도를 실험한 결과 CM-cellulase유전자가 근류형성에 관련될 것으로 추정되었다.