소 난소로부터 회수난포란수의 극대화 방법

Maximization of The Number of Follicular Oocytes Recovered from The Bovine Ovaries

소 초기배의 체외생산을 위한 소 난포란 회수를 극대화할 수 있는 방법을 확립하기 위해 여러 가지 방법에 의해 채취된 난자의 발생능력을 검토하였다. 전통적인 흡입법(대조구), 개발된 회수법(slicing) 및 이들을 결합한 방법(결합법)을 비교하였다. 총 245개의 난소로부터 1,641개의 난포란을 실험에 이용하였다. 회수된 난자는 TCM199과 소 태아혈청을 기초로 한 배양액에서 24시간 체외성숙시켜 급속염색법에 의해 핵성숙을 판별하고, 7% 에탄올에 의해 활성화된 처녀발생란의 전핵형성 유무에 의해 세포질 성숙을 평가하였다. 회수된 평균 난자수는 난소당 흡입법, slicing 및 결합법이 각각 1.87, 11.05 및 7.88개를 얻어 새로 개발된 slicing에 의해 회수율을 5.9배 (11.05/1.87) 증가시킬 수 있었다. 핵 성숙은 흡입법 92.9%, slicing 79.1%와 결합법 71.7%였다. 비록 흡입법에 의해 회수된 난자의 핵 성숙율이 높았지만 난소당 얻을 수 있는 성숙 난자의 수는 slicing할 경우 5배까지 증가시킬 수 있었다. 세포질 성숙의 지표인 전핵의 형성율은 대조구 75%, slicing 67%, 그리고 결합법 62.5%였다. 이같은 결과는 개발된 slicing법에 의해 도살장 난소로부터 보다 많은 수의 난자의 회수가 가능하며 이들의 핵성숙 및 세포질 성숙도 정상적으로 일어나며 난소당 전핵 초기배 수를 증가시킬 수 있음을 보여준 것이다. 아울러 증가된 난자수로 인하여 초기배의 생화학적 분석 및 외래유전자의 미세주입을 위한 지속적으로 안정된 초기배의 공급체계가 확립되었다.

A new technique was established to maximize the numbers of follicular oocytes recovered from the ovaries obtained at the slaughter house. And their further developmental capacity was demonstrated. There recovery techniques were used; aspiration (ASP, control), slicing (SLC) and slicing combining aspiration (ASP+SLC). Recovered oocytes were cultured in TCM 199+15% FCS+gonadotrophins in an atmosphere of 5% CO$_2$ in air at 39$^{\circ}C$ for 24 h. The nuclear maturation was detemined with chromo-some configuration by rapid staining. And cytoplasmic maturation was examined by the formation of female pronuclei with parthenogenetic activation of the matured oocyte after 18 h of co-culture with granulosa cell monolayer. Total 1,641 bovine follicular oocytes recovered from 245 ovaries. The number of oocytcs per ovary was 1.87 in ASP, 11.05 in SLC and 7.88 in ASP+SLC, respectively. SLC would yield 5.9 folds increase, compared with ASP. The rate of maturation were 92.9% in ASP, 79.1% in SLC and 71.7% in ASP+SLC, respectively. Although the maturation rate in ASP was the highest, metaphase II oocytes per ovary in SLC was 5 times higher than that of ASP. The rates of pronuclei formation upon ethanol activation were 75% in ASP, 67% in SLC and 62.5% in ASP+SLC, respectively. The results demonstrate that it should be possible to maximize the number of the follicular oocyte from the ovary for mass production of bovine embryos. Thus the established technique may provide efficient supply of bovine embryos for biochemical and molecular study of early bovine embryos.