Abstract
To elucidate the physiological and biochemical differences between chondrichthyes and osteichthyes, the properties of the specific digestive enzymes in cat-shark, Cephaloscyllium umbratile, and mackerel, Scomber japonicus, were studied. Homogenous trypsin proved through the disc-electrophoresis, SDS-PAG electrophoresis and gel filtration was obtained from the pancreas of cat-shark by $50-70\%$ saturated ammonium sulphate fractionation, DEAE-Sephadex A-50 column chromatography, benzamidine-Sepharose 6B affinity chromatography and Sephadex G-75-120 gel filtration. Two types of trypsins were also obtained from the pyloric caeca of mackerel by $30-70\%$ saturated ammonium sulphate fractionation and the slightly modified procedure from the method adopted in the purification of cat-shark trypsin. The two trypsins, designated trypsin A and B, were proved their homogeneity by disc- and SDS-PAG electrophoresis and gel filtration. The molecular weights of the trypsins were estimated to be 31,700 for cat-shark trypsin, 30,000 for mackerel trypsin A and 29,000 for mackerel trypsin B by SDS-PAG electrophoresis, but those were estimated to be 21,500 for cat-shark trypsin, 23,700 for mackerel trypsin A and 21,500 for mackerel trypsin B by gel filtration. The trypsins exhibited their optimum conditions at pH 9.0 and on temperature ranged from $45^{\circ}C\;to\;50^{\circ}C$ for cat-shark, and at pH 8.0 and a temperature of $50^{\circ}C$ for mackerel trypsin A and B, respectively. The cat-shark trypsin was stable at pH 10.0 and the temperature below $10^{\circ}C$, whereas the mackerel trypsin A and B, were stable in the range over pH 7.0 to pH 9.0 below $10^{\circ}C$ and at pH 8.0 below $35^{\circ}C$, respectively. The mackerel trypsins were severely inhibited by some heavy metal ions such as $Ag^{2+},\;Cu^{2+}\;and\;Hg^{2+}$ compared to cat-shark trypsin. All of the enzymes were also inhibited by antipain, leupeptin, TLCK(tosyllysine chloromethyl ketone) and SBTI(soybean trypsin inhibitor) remarkably. The inhibitory effects of PMSF(phenylmethane sulphonylfluoride), DFP(diisopropyl fluorophosphate) and benzamidine were indicated that these enzymes belong to serine-proteases.
연골어류와 경골어류의 진화에 관한 생리생화학적 차이를 특정한 소화효소의 성질과 구조면에서 밝혀 보고자 본 연구를 시도하였다. 양 어종을 대표하는 종류로서 복상어와 고등어를 시료로 선정하고, 소화효소 중 trypsin을 대상으로 하여, 우선 그 정제방법의 확립, 분자량의 측정, 반응 및 안정성에 미치는 pH 및 온도의 영향, 그리고 금속이온과 화학약제가 반응에 미치는 영향 등을 분석 검토하였으며, 그 내용을 요약하면 다음과 같다. 1. 정제방법에 관하여, 민저 복상어 trypsin은 4 염화탄소로서 탈지 추출한 조효소에 대하여 $50-70\%$ 포화 황산암모늄 염석, DEAE-Sephadex A-50칼럼 크로마토그래피, benzamidine-Sepharose 6B, 친화성 크로마토그래피, Sephadex G-75-120 겔 여과법을 거쳐 disc- 전기영동법, SDS-PAG 전기영동법 및 겔 여과법상 균질상태로 얻었다. 또, 고등어의 trypsin은 역시 4염화탄소로서 탈지 추출한 조효소에 대하여 $30-70\%$포화 황산암모늄 염석, benzamidine-Sepharose 6B 친화성 크로마토 그래피, DEAE-Sephadex A-50 크로마토그래피 등의 재크로마토그래피, benzamidine-Sepharose 6B에 의한 재크로마토그래피 등의 정제과정을 거쳐 disc- 전기영동법, SDS-PAG 전기영동법 및 겔 여과법으로 균질의 가칭 trypsin-A와 B를 달리하였다. 2. 이들 유래를 달리하는 각 trypsin의 분자량은 SDS-PAG 전기영동법으로 측정했을 때, 복상어 trypsin 31,700, 고등어 trypsin-A 30,000, 고등어 trypsin-B 29,000, 그리고 겔 여과법으로 측정했을 때, 복상어 21,500, 고등어 trypsin-A 23,700, 고등어 trypsin-B 21,500이었다. 3. 이들 효소들의 알맞은 반응조건은 복상어 trypsin pH 9.0, $45-50^{\circ}C$, 고등어 trypsin-A와 B pH 8.0, $50^{\circ}C$였다. pH와 온도조건에 따른 안정성을 각각 pH와 온도조건별로 30분간 전처리한 후에 그 활성에 미치는 영향으로 비교해 본 결과, pH의 변화에 대하여는 복상어 trypsin은 pH 10.0에서, 그리고 고등어 trypsin-A는 pH 7.0-9.0에서, 고등어 trypsin-B는 pH 8.0에서 안정하였고, 온도조건에 대하여는 복상어 trypsin은 $25^{\circ}C$까지, 그리고 고등어는 trypsin-A가 $10^{\circ}C$까지, 고등어 trypsin-B는 $35^{\circ}C$까지는 안정하였으나, 그 이후부터는 불안정하였다. 4. 이들 효소들은 공통적으로 금속이온 Ag^{2+},\;Cu^{2+}$ 및 $Hg^{2+}$에 의하여 저해를 받았으며, 그 저해의 정도는 고등어 trypsin-A와 B가 보다 심하게 받았다. 또 이들 효소들은 antipain, leupeptin, TLCK(to-syllysine chloromethyl ketone) 및 SBTI(soybean trypsin inhibitor)에 의하여 현저한 저해를 받았고, PMSF(phenylmethane sulfonylfluoride), DFP(diisopropyl fluorophosphate) 및 benzamidine에 의하여 어느정도 저해를 보여 모두 serine-계의 trypsin임을 뒷받침하였다
(Department of Nutrition and Food Science, National Fisheries University of Pusan)
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