Molecular Cloning of Bacillus stearothermophilus cdd Gene Encoding Thermostable Cytidine/Deoxycytidine Deaminase

Bacillus stearothermophilus 의 내열성 시티딘/디옥시시티딘 디아미나제를 코드하는 cdd 유전자의 클로닝

The Bacillus stearothermophilus cdd gene encoding cytidine deaminase (cytidine/2'-deoxycytidine aminohydrolase; EC 3.5.4.5) was isolated through shot gun cloning by oomplementation of an E. coli cdd mutation. Primarily 3.0 kbp of the exogenote was cloned into the Pstl site of pBR322 (pJSC101). By subsequent deletion and subcloning from the insert of pJSC101 with cdd$^+$ and tetracycline resistancy, about 1.35 kbp of the EcoRI$_1$/PstI$_2$ fragment containing the cdd gene was isolated as pJSC201. The minicell experiment revealed a molecular mass of 33,000 dalton for polypeptide from the cloned DNA fragment complementing the cdd gene. From the lacZ fusion of 550 bp fragment of the EcoRI$_1$/AuaI as a putative promoter region, the transcription direction of the cdd gene on pJSC201 is from EcoRI towards the PstI sites, When the cdd gene was expressed in B. subtilis ED4O (cdd$^-$, pyr$^-$) by transformation with the E. coli-B. subtilis shuttle vector, the gene expression occured more efficiently than in E. coli and the gene appears to be stably maintained in B. subtitis as well as in E. coli.

Bacillus stearothermophilus의 cytidine deaminase (cytidine/2'-deoxycytidine aminohydrolase：EC 3.5.4.5)를 코딩하는 cdd 유전자를 E. coli cdd$^-$ 결손변이주를 cloning host로 하여 3-10Kbp의 B. stearothermophilus DNA 단편으로부터 shot gun 법으로 클로닝하였다. 고 복제수 플라스미드 pBR322 의 PstI 부위에 3.0Kb의 B. stearothermophilus DNA 단편을 함유한 pJSC101이 cdd$^+$와 tetracy-line 내성으로서 cloning되었으며, 이어서, 결실 및 subcloning을 연속 수행한 결과 약 1.35kbp의 Eco RI$_1$/PstI$_2$단편이 동일 부위의 pBR322에 삽입된 cdd 양성의 pJSC201을 얻었다. Mini 세포 실험결과, 이 단편에서 합성되는 polypeptide는 약 33 KDa이었기에 이 polypeptide가 cytidine deaminase 로 추정되었다. 또한 이 단편에 함유한 550bp의 EcoRI/AvaI 부분을 lacZ 프로모터 영역에 삽입한 경우 프로모터 활성을 나타내었기에 이 단편의 Eco RI 부위에서 PstI부위로 cdd 유전자가 전사됨을 알 수 있었다. B. subilis와 E. coli에서 발현이 가능한 shuttle vector에 cdd가 함유된 단편을 삽입한 후 이를 양세포에서 동시 발현시켰을 때 B. subtilis에서 발현시킨 경우가 E. coli에서 보다높은 cytidine deaminase 활성을 나타내었으며 이 유전자는 B. subtilis 에서도 E. coli에서와 같이 안정하게 유지됨을 알 수 있었다.