Abstract
Six plasmids of B. thuringiensis serovar. kurstaki HD73 were detected, with approximate sizes of 7.4, 7.8, 8.1, 11.3, and 75 Kb, as well as a low copied plasmid of similar length to 75 Kb. Partially cured mutants from B. thuringiensis HD73 were obtained either by the treatment of the curing agent, ethidium bromide(0.02 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$) or by spontaneous curing, Acrystalliferous mutants(Cry$^-$) were identified by microscopic observation and immunoblotting with polyclonal antibody against 133 KD deltaendotoxin of HD73. Ten Cry$^-$ mutants were found to be lack of 75 Kb plasmid. These results implicated that this plasmid was associated with delta-endotoxin production, After isolating the mutants, we streaked them on potato dextrose agar, spizizen casamino acid glucose, starch agar, and nutrient agar. Only on starch agar medium did morphologies of Cry$^-$ appear translucent and light greyish. On the other hand, the mutants of B. thuringiensis isolated from Korean soil, designated KBS722, were obtained by the treatment of novobiocin (3 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$). Acrystalliferous mutants of KBS722 were less translucent than HD73 mutants' only on nutrient agar medium. Compared the plasmid profile of the mutants with delta-endotoxin production, the results seemed to indicate that the insecticidal protein gene of B. thuringiensis isolates KBS722 located on about 225 Kb plasmid DNA.
나비목 유충에 독성이 강한 균으로 알려진 Bacillus thuringiensis serovar. kurstaki HD73 을 ethidium bromide(0.02$\mu\textrm{g}$/$m\ell$)처리와 자연적 curing에 의한 내독소 유전자의 위치를 확인하여 변이주간 내독소 생성능을 간이 선별할 수 있는 배지를 선발한 다음 국내 토양에서 분리한 KBS722 균주에 적응하여 그 내독소 단백질 유전자의 위치를 확인한 결과를 요약하면 다음과 같다. HD73-NRRL과 Dul-mage박사로 분양 받은 균주는 약 7.4, 7.1, 8.1, 11. 3, 75kb 및 크기가 75kb와 비슷하고 copy수가 적은 또 하나의 plasmid로 전부 6개의 plasmid를 보유하고 있었으며 IPL 균주는 약 4.0과 70kb plasmid를 더 보유하는 것으로 나타났다. 상기 HD 73 균주들의 내독소 단백질 크기는 모두 133KD 정도였고 HD73의 내독소 유전자는 변이주간 내독소의 현미경 검경과, immunoblotting plasmid DNA 의 전기영동결과 75kb상에 있는 것으로 나타났다. 이들 변이주들을 potato dextrose agar, starch agar, spizizen casamino acid glucose 와 nutrient agar 평판배지에 접종하여 균형태를 관찰하였을 때 내독소 비형성균(Cry-)은 starch agar 배지에서만 반투명하고 균 군락의 색깔이 엷은 회색을 띄었다. 한편 국내 분리균 KBS722를 novobiocin(3$\mu\textrm{g}$/$m\ell$)으로 plasmid를 curing시켜 상기 4가지 배지에 도달했을때 nutrient agar배지에서만 Cry 변이주가 반투명하고 엷은 회색을 나타내었다. KBS722의 내독소유전자는 약 225kb의 plasmid상에 있는 것으로 나타났으며 in vitro에서 쉽게 Cry$^+$주와 Cry$^-$주의 판별이 가능하였다.
