YRp7 vector를 이용한 Bacillus amyloliquefaciens amylase gene의 cloning I I. Saccharomyces cerevisiae에서 발현

Cloning of Bacillus amyloliquefaciens amylase gene using YRp7 as a vector II. Expression of cloned amylase gene in Saccharomyces cerevisiae

B. amyloliquefaciens의 $\alpha$-amylase 유전자가 S. cerevisiae 내에서 형질발현하는 가를 조사하기 위하여 본, 연구에서 YRp7 plasmid에 B. amyloliquefaciens amylase유전자를 cloning하여 만든 pEA24를 형질전환시켰다. 먼저 YRp7 plasmid를 이용하여 형질전환 최적 조건을 검토하여 본 바, PH 7과 8사이, 반응온도 3$0^{\circ}C$에서 40%의 polyethylene glycol(MW 4,000)을 처리한 후 2 %의 agar를 함유한 재생배지에 중층도말 하였을 때 형질전환율이 가장 높았다. 형질전환주로부터 생성된 amylase의 활성을 측정한 결과, S. cerevisiae에서 약간의 amylase활성을 나타내어 최고 B. amyloliquefaciens의 2% 정도였고, 세포외효소는 검출되지 않았다. 이들 형질전환 주가 가지고 있는 pEA24 plasmid의 안정성을 조사한 결과 YRp7보다 불안정하였으며, 추출한 DNA를 전기영동하여 그 band를 확인하였다.

Hybrid plasmid pEA24, shuttle vector YRp7 carrying amylase gene of Bacillus amyloliquefaciens, was transformed to yeast Saccharomyces cerevisiae, and the expression of B. amyloliquefaciens amylase gene in yeast was investigated. The frequency of transformation to S. cerevisiae DBY747 with YRp7 was increased by treatment of 40% polyethylene glycol (MW 4, 000), PH 7.0, at 3$0^{\circ}C$, and by regeneration used 2% top agar. The amount of cellular amylase activity produced by S. cerevisiae containing pEA24 was 2% of that secreted from B. amyloliquefaciens, but in case of S. cerevisiae transformant, the amylase secreted was not detected. A comparison of genetic stability of pEA24 and YRp7 plasmids in yeast was carried out by cultivation of transformants in tryptophan-supplement-medium. The pEA24 plasmid was more unstable than YRp7 in S. cerevisiae. The size of pEA24 extracted from S. cerevisiae transformants was found to be identical with that from E. coli transformants by agarose gel electrophoresis.