Abstract
Conditions for production, fusion and reversion of protoplasts of Aspergillus niger were investigated, and an attempt was made to enhance fusion frequency. Auxotrophic mutants and morphological mutants were induced by U.V. irradiation $(9.9\;erg/mm^2,\;13min)$ on Aspergillus niger. Maximum yield of protoplasts was obtained from 21 hr cultured mycelia by using 1% driselase in 0.6 M KCl or 0.6 M $NH_4Cl$ as osmotic stabilizer. The optimal temperature for mycelium digestion was $30^{\circ}C$, and the optimal pH was 6.0. Protoplasts produced at different digestion period showed heterogeneity in size and vacuole content. Maximal frequency of protoplasts reversion was obtained on 0.6 M KCl stabilized agar medium at pH 5.0. Reversion frequencies of protoplasts produced for 3 hr and 1 hr mycelial digestion were 8.0% and 15.3%, respectively. The optimal concentration of PEG(m.w. 6000) for protoplast fusion was 30%, and that of $CaCl_2$ was $1{\sim}50\;mM$. The optimal pH and period for the reaction of PEG solution were 8.0 and 10 minutes, respectively. Fusion frequencies between auxotrophic protoplasts produced for 3 hr-mycelial digestion were $0.06{\sim}0.42%$, and those for 1 hr-mycelial digestion were $0.09{\sim}0.54%$.
본 실험은 Aspergillus niger의 원형질체 형성, 환원 및 융합 조건을 조사하였으며 아울러 융합 빈도를 높이기 위한 방법을 모색하였다. A. niger에 자외선 $(9.9\;erg/mm^2)$을 13분간 조사하여 영양요구성 변이주 및 형태 변이주를 유도, 분리하였다. 균사체 배양 시간에 따른 원형질체 형성량은 21시간 배양한 균사체에서 최대치를 나타내었다. 세포벽 분해효소인 driselase는 1%농도로 3시간 처리했을 때 가장 효과적이였으며 osmotic stabilizer로는 0.6M KCI과 0.6M $NH_4Cl$이 가장 좋았다. 효소 반응 시간에 따라 형성된 원형질체는 크기와 액포 함유량에 있어 불균일성을 나타내었다. 원형질체의 환원률은 0.6M KCI이 침가된 pH 5.0의 배지에서 가장 높았다. 세포벽 분해효소의 반응시간에 따라 형성된 원형질체의 환원률은, 3시간 반응시켜 형성된 원형질체에서 8.0%, 1시간 반응시킨 것에서 15.3%였다. 영양요구성 변이주간의 원형질체 융합에 필요한 PEG (M.W. 6,000)의 최적 농도는30%였으며 $CaCl_2$의 농도는 $1{\sim}50\;mM$에서 비슷한 최대 효과를 나타내었다. 융합 반응의 최적 pH는 8.0, 최적 반응 시간은 10분이었다. 효소 반응 시간에 따라 형성된 원형질체간 융합률은 차이를 보여, 3시간 반응시켜 형성된 원형질체를 사용했을 때 $0.06{\sim}0.42%$, 1시간 반응시킨 것을 사용했을 때 $0.09{\sim}0.54%$였다.
(Department of Biology, Hanyang University)