유전공학적 방법에 의한 토끼 글로빈 유전자의 재조합과 대장균에서의 발현

Molecular Cloning and Expression in Escherichia coli of a Rabbit Globin Gene

유전자 구조 및 유전정보 흐름의 차이로 인하여 고등생물의 유전자를 미생물에 직접 cloning하면 원하는 유전자 산물을 얻지 못하는 경우가 많다. 이것을 극복하기 위해서는 화학적인 방법으로 유전자를 합성하든지, 또는 역제효소를 사용하여 고등생물의 mRNA로부터 유전자를 합성하여 cloning하는 방법을 사용한다. 본 연구에서는 oligo(dT)-cellulose column 방법으로 순수분리한 plasmid pBR322의 Pst I site에 cloning하였다. 우선 AMV reverse transcriptase로 primary cDNA를 합성하고, 알칼리를 처리하여 주형 RNA를 제거했다. 이번에는 이 primary cDNA를 주형으로 Klenow enzyme과 reverse transcriptase를 차례로 처리하여 double stranded DNA를 합성하고, 이 때 5' end 근처에 형성되는 hairpin loop을 Sl nuclease로 제거했다. Terminal deoxynucleotidyl transferase를 사용하여, 합성된 dsDNA에는 poly(dC) track을, Pst I endonuclease를 처리한 plasmid DNA에서는 poly(dG) track을 각각 붙인다음 이들을 서로 annealing시키고 E. coli에 transformation시켜서 크기가 큰 plasmid를 갖는 clone을 cracking 방법으로 일처 선별하였다. 이렇게 선별된 clone을 in 냐셔 hybridization 방법으로 조사하여 globin DNA가 들어간 colony를 이차 선별하고 여러 restriction enzyme으로 잘라보아 globin DNA가 cloning된 것을 확인하였다. 토끼 hemoglobin으로 immunize한 rat (Wistar)에서 뽑은 제일차 혈청과 염소에서 뽑은 제이차 혈청의 antibody를 사용한 radioimmunoassay방법으로, cloning된 globin gene이 대장균내에서 발현되는 지의 여부를 살펴 보았는데, 박테리아의 $\\beta$-lactamase와 토끼의 globin이 결합된 chimeric protein이 대장균 내에서 다량 합성되며, 이 단백질은 토끼 hemoglobin의 antigenic determinant를 가지고 있음을 알 수 있었다.

The structural gene of rabbit hemoglobin was cloned into Pst I site of pBR322 in E. coli. The complementary DNA (cDNA) was synthesized from rabbit globin mRNA with avian myeloblastosis viral reverse transcriptase, and then RNA was destroyed at pH 11. The double stranded cDNA was synthesized with both Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I and reverse transcriptase and then the hairpin loop was opened with Sl nuclease. Double stranded cDNA was subsequently tailed with dCTP and annealed to dGMP-tailed vector DNA. After transformation and initial screening of appropriate clones by plasmid size, the cloned colonies were identified by in situ colony hybridization using by plasmid size, the cloned colonies were identified by in situ colony hybridization using $[^32P]$-labeled cDNA probes and characterized the inserts with restriction endonucleases. The expression of cloned globin gene was investigated by standard radioimmunoassay using rat anti-rabbit Hb serum as primary antibody and goat antirat IgG serum as secondary antibody. The result suggested that the chimeric proteins (the part of $\\beta$-lactamase from the vector pBR322 and globin from rabbit) were supposedly produced in E. coli and the product had the antigenic determinant of rabbit hemoglobin.