Actinodura roseorufa에서 생산되는 UK-58,852로부터 PKS type I 에 관련된 생합성 유전자의 분리 및 분석

To clone genes related UK-58,852 production, genomic DNA of strain Actinodura roseorufa was used for the construction of genomic library using pOJ446 cosmid vector. The genomic library was screened rising dehydratase PCR product and eryA gene as a DNA hybridization probe. pHD54 was isolated, which contained an approximately 35kb of inserted DNA. BamHI, SmaI and sonicater fragments hybridized to eryA probe. All of pHD54 BgmHI, SmaI and sonicater fragments were subcloned into pGEM7 and some fragments which hybridized to eryA probe were sequenced. The nucleotide sequence was analysed using BLAST program. The sequence identities were observed in KS,AT, KR, ER and PKS loading domains. Also oxidoreductase showed similarity to rifamycin module10, and dTDP-D-glucose 4,6 dehydratase and TDP-D-glucose synthase involved in biosynthesis of sugar showed similarity to Streptomyces argillaceus.

UK-58,852의 생합성에 관여하는 유전자를 분리하기 위해 Actinomadura roseorufa의 genomic DNA와 E. coli-Streptomyces shuttle cosmid vector인 pOJ446이 genomic library를 만들었다. Genomic library는 dehydratase PCR product와 eryA 유전자를 probe로 하여 sugar 생합성 유전자와 polyketide typel 유전자가 집단으로 존재하는 cosmid pHD54를 분리하였고, 이를 제한 효소인 BamHI, SmaI와 Sonicater를 이용해서 subcloning 하였다. 이들의 염기서열을 부분 분석한 결과, polyketide 생합성에 관여하는 ketoacyl synthase, methylmalonyl acyltransferase, ketoreductase, enolreductase 그리고 PKS loading domain 등 polyketide synthase type I 임을 보여주고 있고, BLAST 분석된 결과를 보면 polyketide synthase 유전자는 rifamycin 생합성 유전자와 유사성이 높다. 그리고 sugar 생합성에 관여하는 유전자로는 oxidoreductase, dTDP-D-glucose 4,6 dehydratase, dTDP-D-glucose synthase 그리고 dTDP-4-keto-6-deoxy-D-glycose 3,5-epimerase으로 구성된 gene cluster를 확인하였다. 그리고 염기서열 분석된 유전자중 dTDP-D-glucose synthase를 발현하여 유전자의 기능을 확인하였다.