Abstract
Farnesyl Protein transferase(FPT)는 발암유전자 ras의 단백질 산물인 p$^{21}$의 post-translational modification의 첫 단계인 ras-farnesylation에 관여하는 효소로 본 연구에서는 정제된 FPT와 E. coli에서의 발현 system을 이용하여 FPT의 구조와 기능을 밝히고 이를 FPT 방해제의 설계에 이용하고자 한다. Bovine testis에 존재하는 FPT를 30%-50%의 Ammonium sulfate로 fractionation하고, DEAE-Sephacel, Sephacryl S-300 column을 통과시킨 후 peptide(KKCVIM) affinity column을 이용하여 순수 정제하였다. 정제된 효소의 분자량은 gel-filtration에 의해 100KDa으로 추정되었고 SDS-PAGE 결과 49KDa과 46KDa의 두 subunit로 구성되었음이 확인되었다. 효소활성에는 $Mg^{2＋}$ 와 $Zn^{2＋}$가 필수적이며 최적 pH는 7.0이었다. Yeast의 FPT의 두 subunit 유전자는 Yeast genomic DNA를 template로 사용하고 각 subunit에 specific한 합성된 primer들과 vent polymerase를 이용하여 Polymerase chain reaction을 통하여 얻었다. 두 유전자를 pBluescriptII SK＋ vector를 변형시킨 두 vector, pBSK＋4와 pBChl＋4에 재조합 시킨 후 E.coli에 transformation시켜 발현시켰다. 현재 정제된 Bovine FPT와 E. coli에서 발현된 Yeast FPT의 chemical modification과 site-directed mutagenesis를 통하여 FPT의 active site와 substrate binding site에 관한 연구를 진행시키고 있다.
